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漫談單細胞全基因組定序分析系列文章-選擇適合WGA分析方法

前言: 踏出單顆細胞基因組分析的第一步
1. 哪一種WGA方法適用您的單細胞基因研究呢？
2. 擴增前樣品是單顆細胞，還是微量純化過的DNA？
3. 雙倍體基因體學，ADO影響分析結果
4. 樣品是新鮮或是固定過後的細胞，影響DNA模板完整性
5. 持續優化的單顆細胞基因組分析流程

目前 WGA 的方法大致可歸類為三種類型，以樣本為模板複製數百萬 DNA 片段達到基因組放大效果，分別為

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  分類 說明 舉例
1 PCR – based 以 PCR 的方式為主，進行基因擴增 Ampli1 WGA Kit
2 Random priming + PCR 使用隨機引子，配合控溫 PCR 產生隨機片段擴增基因組 Malbac, Picoplex, Genomeplex kit
3 Random priming + isothermal amplification 使用隨機引子，經 Multiple Displacement Amplification (MDA) 原理產生極長 DNA 聚合鏈擴增基因組 Repli-G kit

進行 WGA 時，除了考量操作流程、成本、產量等因素外，於單顆細胞研究中，最重要的是於 WGA 過程中減少複製偏差產生，當樣品是少量細胞時，因極少量的複製偏差將會被大部分的正確複製產物稀釋或掩蓋，使得後續分子分析時較不受複製偏差影響導致判讀錯誤；然而當樣品是單顆細胞時，若有複製偏差產生，擴增產物會無法正確反應原本樣品的情況導致取得非真實的分析結果。

因引子的模板親和力基於其鹼基組成，使用隨機引子作為 DNA 聚合起始點時，將導致每次擴增放大的產物為隨機片段，另外隨機引子容易產生偏好性親和，導致基因組非平均擴增的狀況產生。

Ampli1™ WGA kit 為現在市面上唯一完全不具有隨機過程的單顆細胞 WGA 試劑組；其擴增開始前，會先以限制酶辨認 genome 的切位將其切成 DNA 片段，並於兩端皆接上相同的 adaptor，如此一來只需以單一的高專一性引子辨認 adaptor 序列，藉由去除引子偏好性影響，配合控溫 PCR，使整體擴增片段可預測。

Ampli1 Kit procedure

Ampli1™ WGA kit 過程包含幾大步驟

  1. 使用限制酶將 genome 切成 19,046,047 個 DNA 片段並於兩端產生相同 sticky end
  2. 依照 sticky end 序列，於片段兩端接上相同 adaptor
  3. 補完 3‘序列
  4. 單一引子辨識 adaptor 序列，開始進行 PCR 擴增全基因組
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DEPArray™ NxT
單細胞分離篩選系統

隨著 DEPArray™ 技術的發展，基因的異質性研究可達單顆細胞層級。可探索每顆細胞基因中隱藏的故事，例如整倍體的基因變異。DEPArray™ 技術可依細胞表型分選，以及運用不同參數組合與影像系統的雙重確認，可確保分選出純度 100% 的標的細胞，採用高純度細胞故可觀察出等位基因表現。

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Ampli1™ WGA Kit
單顆細胞全基因組擴增套組

單顆細胞中使全基因組擴增優化，單一引子進行 PCR，確保相間比例擴增 DNA 片段，平均且完整擴增 DNA 片段，擴增長度 0.2~2K bp 適用任何種類的細胞，單管操作，無需沉澱 DNA，滅少損失，過程快速，手動操作時間 1.5 小時，單顆細胞最多可獲得 4ug DNA 適用於後續的基因分析應用，包括全基因組定序。