為了從ELISpot/FluoroSpot分析結果中看出端倪，在大多數的情況下需要在體外刺激細胞。ELISpot原理為免疫細胞經刺激後產生反應，進而分泌細胞因子或抗體，再透過酵素呈色的方式顯現斑點，每一個點即代表一顆分泌特定細胞激素的免疫細胞。
根據不同目的，其中刺激物可用來 (1) 鑑別抗原特異性免疫反應 或者 (2) 作為實驗控制組，接著我們將帶您深入瞭解不同刺激物的應用方法。

🚩 點我瞭解更多Elispot原理

 

 

 

前言

  • 免疫刺激物的選擇大多取決於細胞類型和實驗性質。
  • 免疫刺激物可以是單株抗體、胜肽、合成化合物，或從細菌與植物所純化的物質。

Mabtech提供多種不同的多克隆刺激物註1與抗原特異性刺激物，所有的刺激物皆經過ELISpot與FluoroSpot 試驗驗證與優化。Mabtech大多數的刺激物為單株抗體或胜肽混合物註2 (稱為PepPools)，PepPools可作為實驗控制組或辨別抗原特異性免疫反應。

註1：指多種T細胞或B細胞克隆對同一種抗原產生反應。
註2：胜肽混合物由Peptide pools翻譯得來，後Mabtech慣稱為PepPools。

 

 

值得信賴的免疫學專家團隊 – Mabtech

Mabtech的ELISpot/FluoroSpot kits可用來評估候選疫苗的效力、研究癌症抗原或過敏原等廣泛的免疫相關主題，而Mabtech開發這類的研究試劑首要目地是為了提供通用的材料包，研究人員可搭配不同的刺激物來觀察特異性的免疫反應。

Mabtech supplies the common material; you bring the specific stimulus.

近年來，因應特定研究主題對於高品質免疫刺激物的需求逐漸攀升，故Mabtech開發了新的產品線 – PepPools，對於想做病原體相關研究卻缺少抗原相關的知識背景或管道的用戶帶來莫大的幫助。

另外，值得一提的優勢是Mabtech所生產的免疫刺激物皆經ELISpot與FluoroSpot驗證，且在相關的感染個體中確認過作用效果，可確保能夠引起免疫細胞的反應。

 

 

🔅 大多數PepPools也適用於流式細胞儀分析 🔅

 

 

針對特定研究主題選擇合適的免疫刺激物

Mabtech PepPools分為defined或scanning兩種形式，簡單來說：

(1) 已經確定想要看的HLA表位 → 選defined PepPools

(2) 不瞭解或不需要看特定表位 → 選scanning pools。

scanning pools
  • 旨在涵蓋整個蛋白質或結構區，不需瞭解特定表位。
  • 一般來說，在不確定樣品中HLA/MHC的組成時，scanning pools是較安全的選擇。

defined PepPools
  • 產品名稱註明特定HLA/MHC分子，都是被鑑別為具免疫優勢 (immunodominant)的抗原，可引起較強烈的免疫反應。
  • 若已知樣品中HLA組成，則defined PepPools會是最佳首選。

 

 

🔅 Mabtech提供一系列常見病原體相關的PepPools，產品項目持續更新中 🔅

若用戶利用Mabtech的PepPools進行研究且尚未購買ELISpot或FluoroSpot試劑盒，推薦選購Mabtech Path kit系列產品 — 組合PepPools 與ELISpot/FluoroSpot kit的完整包裝。

 

 

🔅 EBV和CMV等病原體普遍出現在人群中，故多作為試驗中的陽性對照組 🔅

表1、適合特定研究主題的PepPools
免疫刺激物 目標細胞類型 病原體 刺激後分泌
PepPool: TB (EspC), scanning T cells (scanning pool)

｜結核病｜
 結核分枝桿菌

 IFN-γ, IL-2
PepPool: TB (ESAT-6), scanning T cells (scanning pool) IFN-γ, IL-2
PepPool: TB (CFP-10), scanning T cells (scanning pool) IFN-γ, IL-2
PepPool: CMV (CD4 and CD8), human CD4+ and CD8+ T cells 巨細胞病毒 IFN-γ, IL-2, IL-5, IL-13
PepPool: CyCMV+RhCMV (TP-UL83+Rh112), scanning T cells (Macaque) IFN-γ, IL-2
PepPool: EBV (CD4 and CD8), human CD4+ and CD8+ T cells 第四型人類皰疹病毒 IFN-γ, IL-2
PepPool: AdV5 (hexon), human T cells 人類腺病毒 IFN-γ, IL-2
PepPool: Vaccinia (CD4), human CD4 T cells ｜天花｜猴痘｜
 牛痘病毒		 IFN-γ
PepPool: Vaccinia (CD8), human CD8 T cells IFN-γ
PepPool: SARS-CoV-2 (SNMO), human T cells ｜COVID-19｜
 SARS-CoV-2		 IFN-γ, IL-2, Granzyme B
PepPool: SARS-CoV-2 (S), human T cells IFN-γ, IL-2, Granzyme B
PepPool: SARS-CoV-2 (NMO), human T cells IFN-γ, IL-2, Granzyme B
PepPool: SARS-CoV-2 (S1), scanning T cells (scanning pool) IFN-γ, IL-2, Granzyme B
PepPool: SARS-CoV-2 Omicron BA.1 (S1), scanning T cells (scanning pool) IFN-γ, IL-2, Granzyme B
For HLA coverage of the different pools, please refer to the respective product page or datasheet.

 

 

 

為什麼Mabtech提供這麼多種SARS-CoV-2的PepPool

ANS: 不同刺激物可基於不同目的回答不同問題。

  • PepPool: SARS-CoV-2 (SNMO), human à 一般COVID-19免疫相關問題的首選。
  • PepPool: SARS-CoV-2 (S1), scanning à 如果在前項產品中沒有覆蓋到有興趣的HLA，則考慮scanning pools。

美國Sette實驗室所發表的論文 (Yu et al, Cell Host & Microbe, 2022) 提出如何通過分別研究IFN-γ對spike和non-spike proteins的反應來區分接種疫苗和自然感染的免疫反應。若分別使用Mabtech的PepPool: SARS-CoV-2 (S), human與PepPool: SARS-CoV-2 (NMO), human進行刺激，則可區別 SARS-CoV-2自然感染與疫苗接種的反應。

 

 

不同的胜肽混合物可以『混合』使用

可根據研究主題或實驗需求混合不同的胜肽刺激物，例如不需要看CD4與 CD8 的個別反應，只想看總T細胞反應；或者想讓陽性控制組中的細胞反應更全面，也可將EBV與CMV混合使用。

That works!

唯一可能產生的風顯示DMSO的濃度可能變得太高，進而導致損害細胞膜並對細胞產生毒性。

Mabtech也提出了解決方案，只需要在第一管中加入40 μl DMSO，然後將所有液體移至下一管中，也不要忘了用PBS沖洗管壁。(參考下圖)

 

 

陽性對照組的免疫刺激物怎麼選

PHA或PMA/Ionomycin多用來刺激T細胞多克隆的活化。

從Mabtech的觀點，抗原特異性的刺激也可用於對照組，對於細胞的活化也更加準確；缺點在於可能不適用所有的HLA類型或物種。

 

 

多克隆T細胞刺激

以anti-CD3抗體作為T細胞多克隆刺激物，Mabtech提供human與monkey的CD3 mAb，可刺激多種細胞因子的分泌。

 

 

🔅 相較於凝集素 (lectins)等物質，使用單株抗體的優勢在於可降低批次間的變異 🔅

PHA和Concanavalin A (ConA)等凝集素也是有效的T細胞刺激物，Mabtech目前雖沒有提供，但PHA和ConA有許多通路可購買、也有不同效力的產品可挑選。

 

 

🔅 因為多克隆刺激物可活化的細胞較多，故Mabtech建議實驗細胞數僅需約50,000 cells/well 🔅

 

 

抗原特異性T細胞刺激

已知用來刺激特異性反應的抗原也可作為陽性對照組的刺激物，許多實驗設計會採用ELISpot/FluoroSpot偵測抗原特異性CD8 T細胞產生IFN-γ的反應，針對這類型的應用Mabtech開發了抗原特異性陽性對照組 — PepPool: CEF (CD8), human。

另有反應更全面的PepPool: CEF extended (CD8), human，以及用來刺激CD4 T細胞的PepPool: CEFTA (CD4), human，以上三種PepPools也適用於流式細胞儀的分析。

PepPool: CEF (CD8), human
包含23種病毒肽，在9成高加索人種中可刺激人類CD8 T細胞並主要產生IFN-γ反應。其中胜肽來自CMV、EBV和流產病毒，包含MHC-I限制性T細胞表位，可刺激多種HLA類型的T細胞；也可在許多個體的細胞中引起Perforin和Granzyme B的反應。除了作為陽性對照組，CEF胜肽混和物也可用於標準化程序。
PepPool: CEF extended (CD8), human
包含32種病毒肽，在9成高加索人種中可刺激人類CD8 T細胞並主要產生IFN-γ反應。其中胜肽來自CMV、EBV和流產病毒，包含MHC-I限制性T細胞表位，可刺激多種HLA類型的T細胞；也可在許多個體的細胞中引起Perforin和Granzyme B的反應。
PepPool: CEFTA (CD4), human
由人類CMV、EBV、流產病毒、破傷風毒素和腺病毒的35種MHC-II限制性病毒肽組成，可刺激人類CD4 T細胞分泌IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-13，在使用人類PBMC進行ELISpot或FluoroSpot分析時可作為陽性對照。

 

 

 

 

▲ Depletion of CD4 and CD8 cell respectively, reveal that PepPool: CEF (CD8), human indeed predominantly stimulate CD8 T cells.

 

 

單核細胞/樹突細胞的多克隆刺激

TLRs的配體可以作為刺激單核細胞和樹突細胞的陽性對照，從細菌純化的脂多醣 (Lipopolysaccharides, LPS)通過TLR4作用可有效刺激IL-1β、IL-6 和TNF-α的分泌。另外，化合物R484是TLR7/8的配體，可刺激IL-1β等細胞因子的分泌。

  • Mabtech沒有提供LPS，但用戶仍可由其它通路購買。
  • Mabtech不單獨販售R484，其與IL-2組合販售，可參考StimPack: Memory B cells, human產品說明。

 

 

B細胞的多克隆刺激

記憶型B細胞在分泌可檢測的抗體量之前，需要多克隆的刺激，可使用混合化合物R484與重組IL-2的StimPack: Memory B cells, human或StimPack: Memory B cells, mouse進行實驗。

表2、適合作為陽性對照組的免疫刺激物
免疫刺激物 目標細胞類型 病原體 刺激後分泌
PepPool: CEF (CD8), human CD8+ T cells (human) CMV, EBV and influenza IFN-γ, IL-2, Granzyme B, Perforin
PepPool: CEF extended (CD8), human CD8+ T cells (human)
PepPool: CEFTA (CD4), human CD4+ T cells (human) CMV, EBV, TT and influenza IFN-γ, IL-2, IL-5, IL-13
Anti-human CD3 mAb (CD3-2), azide free T cells (human) 多克隆T細胞活化 IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 and IL-17A
Anti-monkey CD3 mAb (CD3-1), azide free T cells (non-human primate)
Phytohemagglutinin (PHA)* T cells IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17A, IL-21, GM-CSF, Granzyme B, Perforin
StimPack: Memory B cells, human B cells (human) 多克隆B細胞活化
(R848 + IL-2)		 IgG, IgA, IgM
StimPack: Memory B cells, mouse B cells (mouse)
Anti-human CD40 mAb (S2C6), azide free + recIL-4 B cells 多克隆B細胞活化 IgE
Lipopolysaccharide (LPS)* Monocytes/DC TLR4 IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-23, GM-CSF, TNF-α
R848* Monocytes/DC TLR7/8 IFN-α, IL-1β, IL-6, IL-23, GM-CSF, TNF-α
*not sold by Mabtech (yet)

 

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