酶聯免疫吸附分析 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)

ELISA免疫分析試驗最初於1970年代開始發展，現今為實驗室及臨床診斷常用的檢驗技術之一。技術原理簡述由分析盤上的特異性單株抗體 (mAb)捕獲目標蛋白，再由另一支成對的單株抗體偵測並進行酵素呈色，最終藉由標準曲線進行絕對定量。

  ▲ELISA實驗流程示意圖。(1) 96孔盤上披覆Capture Ab (2) 加入待測樣品 (3) 加入與步驟1成對的Detection Ab (4) 加入酵素 (5) 加入受質 (6) 分析與定量

 

臨床檢體中的干擾因子

可能存在樣品中的干擾因子會影響抗體抗原的專一性結合，最終造成偽陽性 (false positive)結果。

干擾因子主要可分為以下兩種：

嗜異性抗體 (heterophile antibody)

泛指能與二種以上不同來源的抗原作用的抗體，常見人類樣品中的「抗動物免疫球蛋白」抗體 (human anti-animal immunoglobulin antibodies, HAIA) 即為其一，例如人抗鼠抗體 (human anti-mouse antibodies, HAMA)。

此類抗體具有高度親和力及結合力，誘發來源可能為接觸動物產品、接受抗體免疫治療、受病原體感染或自體免疫疾病等 [1]

類風溼因子 (rheumatoid factor, RF)

為一種自體抗體，最早是在類風濕關節炎患者身上發現，主要以IgM的形式存在。

廣義來說，RF也是一種嗜異性抗體，可與自身體內的免疫球蛋白IgG的Fc結合，進而引發可能造成組織器官損害的免疫反應 [1]。

 

 

干擾因子如何影響ELISA結果

常規ELISA分析正確的ELISA分析是藉成對抗體 (Capture Ab & Detection Ab)與分析物的專一性結合後，再行酵素反應呈色分析。真實訊號
存在干擾因子若檢體中存在會與其它抗體進行非特異性結合的干擾因子，則干擾因子與ELISA成對抗體交互作用，最終出現偽陽性結果。偽陽性結果

 

 

RF因子並非類風濕關節炎患者的專利

除了可在類風溼關節炎患者中檢測出RF陽性 (約7到9成)；其他自體免疫疾病患者，例如：乾癬、紅斑性狼瘡、全身性硬化症等；細菌、病毒、寄生蟲感染或慢性疾病、吸菸、癌症等，也都可發現RF因子的蹤跡。

值得注意的是，健康個體中也可能出現RF因子，甚至隨著年齡增長，檢出RF的比例也會隨之增加[2]。

▲ 在不同族群與疾病患者中檢測出RF陽性的比例[2]。

 

 

 

偽陽性訊號影響臨床診斷與治療決策

嗜異性抗體干擾hCG檢測值而誤診為惡性腫瘤

12位未懷孕的婦女，因持續檢出hCG[註]而被診斷為惡性絨毛膜癌，其中大部分患者接受了摘除手術與化療，但後續由不同檢測方式追蹤發現：最早在血清中驗出的hCG是由嗜異性抗體所造成的偽陽性結果[3]。

註: hCG為人類絨毛膜性腺激素，可用來檢測女性是否懷孕。有些癌症也會使血液中的hGC值偏高，臨床上採用ELISA方式進行血清檢驗。

 

嗜異性抗體干擾使心肌旋轉蛋白檢測值異常

一名患有肥胖、高血壓、糖尿病等多種慢性病史的76歲女性，為裝置心律調節器而入院進行常規性檢驗，結果發現troponin I (cTnI) [註]異常超標 (檢測值2.13-2.85 µg/L；正常值 <0.04)，但整合其他檢查結果並無發現心肌梗塞等相關徵兆。經後續追蹤檢測並採用嗜異性抗體阻斷劑(blocking buffer)重新分析，最終認為當時的troponin I檢測值是受到樣品中嗜異性抗體的干擾[4]。

註: Troponin I為心肌旋轉蛋白，是用來診斷心肌梗塞的重要指標，臨床上採用ELISA進行血清檢驗。

▲ 心肌旋轉蛋白 (cardio specific troponin I )檢測值。(○)為未經處理的血漿檢測值; (●)為嗜異性抗體阻斷劑 (blocking buffer)處理後的檢測值; 虛線為參考正常值。   

 

新冠抗體血清檢測的偽陽性可能影響醫療策略

血清學研究在流行病學中相當重要，可協助了解病毒感染進程與人體免疫應答機制。在2019年新冠肺炎疫情爆發後，各國廠商紛紛投入快篩試劑的研發，協助研究人員快速掌握檢測數據。然而，針對特定族群的血清檢測，例如免疫相關疾病的患者，則容易因血清中的干擾因子比例高而造成偽陽性的結果。

有研究顯示：取疫情爆發前慢性發炎疾病患者的血清檢測SARS-CoV-2抗體，在17家不同廠牌的檢驗試劑中，約有2～45% 的比例會出現偽陽性 (如圖)。

故極力呼籲，在研發或進行血清學相關的研究時，應將嗜異性抗體與RF因子可能造成的干擾納入考慮，因錯誤的檢測結果可能導致錯誤的醫療決策，甚至影響防疫策略[5]。

 

 

 

 

降低偽陽性的風險可提高臨床檢測的可信度

細胞因子(cytokine)是體內訊號傳遞的使者，除了調控免疫系統、也參與了許多重要的生理功能。分析細胞因子不只是學術研究探討各種分子機制的基礎，在臨床上也可做為疾病診斷或預後評估的重要生物指標。

Gehin et al. 等人觀察一項關節炎世代研究中的樣品，討論RF因子在免疫分析試驗中可能對結果造成的影響。在多重因子試驗 (multiplex cytokine assay) 的結果顯示，70% 血清樣本會受到RF因子干擾，其中17/27的細胞因子觀察到顯著差異，包括常見的IFNγ、IL10、TNFα和IL-6等。

由於這些細胞因子在研究及臨床診斷上具重要意義，故作者在文中強調進行相關免疫試驗前，應做好適當的「防護措施」，避免檢體受RF因子或嗜異性抗體干擾而導致結果偏差[6]。

▲ 來自10位關節炎患者的血清樣品，透過多重因子試驗 (BioRed 27-plex cytokine assay)分析27種細胞因子的含量並比較有無添加阻斷劑的數值 (unblock/block)。比值 >1.5或 <0.5則判定為此檢體在檢驗中受干擾。

 

 

 

如何得知檢測樣品中是否存在干擾因子

  • 檢體連續稀釋後，若檢測結果並非線性，則檢體中存在干擾因子。
  • 使用不同技術方法分析檢體，確認結果的可信度。
  • 使用不成對抗體免疫分析法 (unmatched ELISA)測試檢體。
    ●    使用分別對應不同抗原的兩支抗體 (即不成對抗體)進行ELISA分析特定標的物的訊號。

    • 不存在干擾因子：沒有訊號產生
    • 存在干擾因子：出現偽陽性訊號

▲ 不成對抗體分析法示意圖。

 

 

如何避免臨床檢體中干擾因子的影響 [7]

  • 免疫干擾阻斷劑 (Blocking Buffer)
  • 利用多種免疫球蛋白先行阻斷檢體中非特異性結合的抗體
  • 檢體前處理 (pre-treatment):
  • 萃取檢體中的目標分析物 (e.g., 凝膠層析法)
  • 免疫萃取 (固相proteinA懸浮液)
  • PEG 6000沉澱
  • 將檢體加熱至70 ~ 90°C (以目標檢測物可耐高溫為前提)
  • 採用不同物種來源的Capture Ab與Detection Ab
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Mabtech ELISA PathRF系列產品有效降低干擾因子的影響

目前市面上的免疫分析套組大多附有阻斷劑 (blocking buffer)來減少嗜異性抗體的干擾。然而，嗜異性抗體並非單一形式存在，關於檢體中干擾因子的濃度或種類，目前仍缺乏有效的分析方法，故阻斷劑的抑制效果有限[1,6]。
Mabtech新推出的ELISA免疫分析套組系列產品 -- ELISA PathRF，重組蛋白合成的偵測抗體恆定區骨架 (Fc fragment)經過改造後，再搭配專用的RF-blocking 阻斷劑，可有效降低干擾因子所造成的偽陽性結果。

 

 

 

Mabtech ELISA PathRF效果經過RF陽性檢體驗證

不成對抗體ELISA檢測類風溼關節炎患者檢體
利用不成對抗體的ELISA可確認所獲得的訊號為真實或是偽陽性，因不成對抗體不能產生真正的訊號，若獲得訊號則表示檢體中存在干擾因子而導致偽陽性結果。

▲ 來自100位類風濕關節炎患者的血漿樣品，以不成對抗體ELISA分析，檢驗結果顯示：一般ELISA流程所得的偽陽性訊號頻率高；而使用ELISA PathRF 組別則幾乎沒有偵測到偽陽性的訊號。

 

Spike recovery assay效能驗證

血漿中加入已知濃度的待測物，利用ELISA測定後分析測定量與添加量的比值以計算回收率，可評估產品的精准度 (precision)、線性 (linearity)與特異性 (specificity)。

▲ Spike recovery assay方法示意圖

 

在健康貢獻者與RF陽性的血漿樣品中加入已知濃度的標準，利用ELISA PathRF試劑進行定量，最終健康來源組別回收率可達100%以上；RF陽性組別的回收率也可超過80%。其中，RF陽性組別的RF含量相當高，最終仍取得良好的分析結果。

 

▲ 健康來源組別與RF陽性組別中添加量與測定量的比率。

 

選擇MABTECH ELISA PathRF提升臨床診斷的正確性

ELISA在臨床醫學中有著重要的功能，可測定檢體中特定抗原的含量以進行後續的醫療評估。然而，血清學檢測可能因種種因素無法達到百分百的準確，但撇除外在的干擾，實驗人員可透過試劑的選擇，大大降低檢體內干擾因子的影響，進而提升數據的準確性與可信度，也為醫護人員與患者帶來更多福祉。

 

 

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參考文獻

  1. Bolstad, Nils, David J. Warren, and Kjell Nustad. "Heterophilic antibody interference in immunometric assays." Best practice & research Clinical endocrinology & metabolism 27.5 (2013): 647-661.
  2. Ingegnoli, Francesca, Roberto Castelli, and Roberta Gualtierotti. "Rheumatoid factors: clinical applications." Disease markers 35.6 (2013): 727-734.
  3. Rotmensch, Sigi, and Laurence A. Cole. "False diagnosis and needless therapy of presumed malignant disease in women with false-positive human chorionic gonadotropin concentrations." The Lancet 355.9205 (2000): 712-715.
  4. Lippi, Giuseppe, et al. "Interference from heterophilic antibodies in troponin testing. Case report and systematic review of the literature." Clinica Chimica Acta 426 (2013): 79-84.
  5. Kharlamova, Nastya, et al. "False positive results in SARS-CoV-2 serological tests for samples from patients with chronic inflammatory diseases." Frontiers in immunology (2021): 1365.
  6. Gehin, Johanna E., et al. "Rheumatoid factor and falsely elevated results in commercial immunoassays: data from an early arthritis cohort." Rheumatology international 41.9 (2021): 1657-1665.
  7. Tate, J., & Ward, G. (2004). Interferences in immunoassay. The clinical biochemist reviews, 25(2), 105.