單細胞分析可以研究細胞群內的細胞變異，是深入瞭解腫瘤異質性與疾病藥物開發的關鍵方法，而成功的單細胞基因組分析起始於合適的全基因組擴增 (WGA) 步驟，再搭配優化的定序方法和生物資訊分析來執行。

 

Ampli1 WGA是市面上唯一「非隨機」全基因組擴增方法

 

  • 原理
    • Ampli1 WGA採單一高特異性引子進行PCR，確保兩個等位基因平均擴增。
  • 特點
    • 平均且穩健的擴增技術，適合應用單細胞與少量細胞分析流程。
    • 和其它擴增技術相比，提供更強大且高再現性的擴增效率。
    • 等位基因丟失率 (ADO) 最低，不再錯過重要的遺傳數據。

 

▲ 特定限制酶切位搭配單一引子進行PCR擴增，達到穩定且高再現性的擴增效果。

 

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等位基因丟失率低

  • 大多數WGA方法採隨機擴增，容易造成兩個等位基因不平均放大，導致ADO比例高。
  • Ampli1™ WGA特殊的設計原理可以提供穩定的擴增效率，減少放大不平衡的情況並降低ADO發生機率。

 

 

適用活細胞與固定細胞的強大擴增能力

  • 產品適用性高，不需針對不同樣品購買不同試劑盒。
  • 和其它WGA方法相比，Ampli1™ WGA擴增後在新鮮細胞與固定細胞的系統雜訊 (DLR) 都較低，對於後續進行拷貝數變異可取得更高解析度的分析結果。

 

與市面上八種WGA試劑盒進行多面向的擴增效率評估


2022年發表於International Journal of Molecular Sciences的文獻。

作者取已知的單一克隆細胞，利用八組不同品牌的WGA 試劑盒進行擴增，每組擴增 25 個單顆細胞，最後再通過 STR 評估 WGA 的擴增效果。

STR 對於重複單元的擴增錯誤非常敏感，可利用異型合子表現豐富的位點來評估 WGA 試劑盒的均勻擴增效果。

文章指出，使用 Ampli1 進行全基因組擴增可以最平均擴增等位基因且細胞間的再現性最高，是單細胞基因組異型合子比較分析的最佳選擇。

 

 

 實驗結果


Positive control (文中未提及，應未經擴增)

◌    取群細胞 Bulk作為控制組，與單細胞擴增結果作比較。

1)  單一細胞擴增覆蓋

    • 每個點代表一個單細胞的擴增結果，位置越高表示單顆細胞被擴增的位點越多。
    • 結果顯示Ampli1大部分的擴增結果落在較高的區域。

 

 

2)  異型合子等位基因平均擴增

    • 趨近0.5表示完美平衡擴增結果，趨近0/1標示不均勻擴增。
    • 結果顯示Ampli1大部分的擴增結果集中在0.5附近，僅次於群細胞的擴增結果。

 

 

3)  擴增結果的再現性

    • 觀察在2～5個單細胞 (x-axis)中，重複擴增成功的位點 (y-axis)。
    • 結果顯示Ampli1擴增的再現性遠高於其它品牌。

 

 

4)  擴增噪值

    • 噪值分佈位置越低越好。
    • 結果顯示在Ampli1、Malbac和PicoPlex觀察到較多雜訊，作者歸納原因來自擴增原理的差異： MDA試劑盒相使用的Phi29 DNA準確性較高且反應溫度較低，產生雜訊的機率較少。

 

5)  成功率

    • STR圖譜比較reference基因組，評估擴增成功率，位置越高表示成功率越高。
    • 結果顯示Ampli1大部分的擴增結果落在較高的區域。

 

 

作者結論

全基因組擴增是單細胞研究的重要因素，作者比較八種市售WGA試劑盒，測量大量基因座與等位基因，觀察到Ampli1是最能平均放大等位基因的產品。
雖然從這次和過去的WGA比較可以發現目前並沒有萬能的WGA產品，但考量整體成功率與一致性，作者選擇Ampli1作為STR平台最合適的擴增試劑盒。

 

 

參考文獻

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