▶ 高靈敏的免疫分析方法
▶ 直接捕獲免疫細胞所分泌的細胞激素或免疫球蛋白
▶ 螢光偵測技術可同時分析多種分析物 (至多四色)
▶ 效能高且實驗流程標準化
▶ 適合應用大規模試驗
技術原理
FluoroSpot應用雙抗夾心分析技術 (sandwich assay principle)，將混合的單株捕獲抗體 (capture antibodies)披覆在96孔盤的PVDF膜上，可偵測同時分泌四種分析物的細胞 (quadruple-secreting cells)，再利用標記有生物素或tag的偵測抗體 (detection antibodies)與帶有特異性螢光基團的試劑進行呈色，最終以自動化分析儀分析斑點數。
分析免疫細胞多功能性
FluoroSpot適用於同時分析分泌多種細胞激素或免疫球蛋白的細胞，若選擇三色FluoroSpot，則在單次實驗中至多可分析到7種細胞亞群，包含：可分泌單一分析物、分泌兩種分析物與分泌三種分析物的細胞亞群 (見下圖說明)；若為四色FluoroSpot，至多可辨別15種細胞亞群。
▲ 3-color FluoroSpot可辨別7種細胞亞群。
捕獲效應
同時披覆特異性不同的捕獲抗體，在一種細胞激素被捕獲後，可能會影響到其它細胞激素的分泌，這種現象稱為捕獲效應 (capture effects)或細胞激素吸收效應 (cytokine absorption effects)。
加入anti-CD28共同刺激
Anti-CD28 mAb與T細胞上的CD28結合，與抗原特異性反應產生共同的刺激訊號，可增強抗原特異性反應並抵銷捕獲效應。
舉例來說，IL-2捕獲抗體捕捉到T細胞分泌出來的IL-2後，便會減少IL-2所引導的T細胞刺激反應，故會進一步減弱T細胞的活化。添加anti-CD28 mAb可以回復IFN-γ的反應 (參考下圖)，但仍須根據不同細胞刺激作調整，若anti-CD28 mAb濃度過高可能導致非特異性的細胞激素分泌發生。
▲ 捕獲效應通常可藉由添加anti-CD28 mAb抵銷反應。
實驗步驟
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1. Coating 將混合後的特異性單株捕獲抗體披覆在乙醇處理過的PVDF膜上。 |
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2. Cell incubation 將添加/未添加活化刺激物的細胞分別加到96孔盤中，並培養一段時間讓細胞分泌細胞激素或免疫球蛋白。 |
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3. Cytokine capture 被活化的細胞所分析的細胞激素或免疫球蛋白會立即與96孔盤上的捕獲抗體結合。 |
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4. Detection antibodies 移除細胞後，加入標記tag或生物素的偵測抗體混合物。 |
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5. Fluorophore-labeled conjugates 為了放大偵測訊號，加入標記螢光基團的抗體與streptavidin後，再加入Fluorescence enhancer。 |
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6. Analysis 分析盤乾燥後，利用自動化免疫斑點分析儀的不同濾片分析斑點數。 |
產品包裝
Mabtech根據用戶的需求不同，提供客製化或商業標準化等不同包裝規格的產品。
- FluoroSpot Flex: 客製化包裝，用戶自行搭配有興趣的分析物組合。
- FluoroSpot Plus: 已經驗證的商品化試劑組、pre-coated分析盤可將盤與盤之間的差異性降到最低。
- FluoroSpot Path: 提供已驗證的抗原，針對特定抗原的免疫反應進行研究，例如：SARS-CoV-2 (COVID-19)
應用方向
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文獻選讀
COVID-19 疫苗開發
2020 Cell Press
A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19.
- 利用ELISpot分析施打疫苗後IFN-γ, TNF-alpha, IL-2, IL-4, IL-6的變化，觀察SARS-CoV-2 RBD特異性T細胞的反應性。
細胞治療–樹突細胞疫苗
2018 Nature Protocols
Promoting the accumulation of tumor-specific T cells in tumor tissues by dendritic cell vaccines and chemokine-modulating agents.
- 利用ELISpot評估治療過程中腫瘤內特異性CTLs的數量變化，用以偵測、定量腫瘤特異性免疫反應。
帕金森氏症早期診斷
2020 Nature Communications
α-Synuclein-specific T cell reactivity is associated with preclinical and early Parkinson’s disease.
- 利用triple-color IFNγ, IL-5, and IL-10 Fluorospot 分析α-syn 特異性T細胞的反應，並評估CD4+, CD8+ T細胞功能與數量。
自體免疫疾病–多發性硬化症
2019 Journal of Autoimmunity
Myelin oligodendrocyte glycoprotein revisited—sensitive detection of MOG specific T-cells in multiple sclerosis.
- 利用具高靈敏度的FluoroSpot偵測MS患者細胞樣本IFN-γ/IL-17A/IL-22的變化，觀察在不同實驗設計下其特異性T細胞的反應。
癌症研究–腫瘤浸潤B細胞
2019 Cancers
Human Colorectal Carcinoma Infiltrating B Lymphocytes Are Active Secretors of the Immunoglobulin Isotypes A, G, and M.
- 作者利用IgA/IgG/IgM FluoroSpot分析TiBc分泌免疫球蛋白的功能性，且提出FluoroSpot具有高靈敏度與低背景值等特性。
文獻來源
- Zhang et al. (2020). A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19. Cell Press 182, 1271–1283.
- Obermajer,N et al. (2018). Promoting the accumulation of tumor-specific T cells in tumor tissues by dendritic cell vaccines and chemokine-modulating agents. Nature Protocolsvolume 13, 335–357.
- Arlehamn, C. (2020) ‘α-Synuclein-specific T cell reactivity is associated with preclinical and early Parkinson’s disease’. Nat Commun. 11(1):1875.
- Bronge, M. (2019). Myelin oligodendrocyte glycoprotein revisited—sensitive detection of MOGspecific T-cells in multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 102:38-49.
- Mullins, C. (2019) ‘Human Colorectal Carcinoma Infiltrating B Lymphocytes Are Active Secretors of the Immunoglobulin Isotypes A, G, and M’. 11(6):776.
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