Mabtech FluoroSpot Kit 螢光免疫斑點分析套組

FluoroSpot結合ELISpot高靈敏度的特點,可在同一孔位同時分析至多四種分析物,研究不同的細胞功能性並提升實驗效益。

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品牌:Mabtech

 

    ▶ 高靈敏的免疫分析方法

    ▶ 直接捕獲免疫細胞所分泌的細胞激素或免疫球蛋白

    ▶ 螢光偵測技術可同時分析多種分析物 (至多四色)

    ▶ 效能高且實驗流程標準化

    ▶ 適合應用大規模試驗

 

 

技術特點

FluoroSpot可從單細胞層面同時偵測多種分析物,為高靈敏性的細胞分析技術,高效且容易執行,適合單次試驗或大規模篩選。分析物從細胞激素到免疫球蛋白皆適用

 

技術原理

FluoroSpot應用雙抗夾心分析技術 (sandwich assay principle),將混合的單株捕獲抗體 (capture antibodies)披覆在96孔盤的PVDF膜上,可偵測同時分泌四種分析物的細胞 (quadruple-secreting cells),再利用標記有生物素或tag的偵測抗體 (detection antibodies)與帶有特異性螢光基團的試劑進行呈色,最終以自動化分析儀分析斑點數。

👉 FluoroSpot brochure

 

分析免疫細胞多功能性

FluoroSpot適用於同時分析分泌多種細胞激素或免疫球蛋白的細胞,若選擇三色FluoroSpot,則在單次實驗中至多可分析到7種細胞亞群,包含:可分泌單一分析物、分泌兩種分析物與分泌三種分析物的細胞亞群 (見下圖說明);若為四色FluoroSpot,至多可辨別15種細胞亞群。

▲ 3-color FluoroSpot可辨別7種細胞亞群。

 

T cell FluoroSpot

      ▲ 4-color FluoroSpot可辨別15種細胞亞群。

 

 

B cell FluoroSpot

    ▲ B cell FluoroSpot 可在單一孔位同時分析分泌不同免疫球蛋白的細胞亞群。

    👉 瞭解B-cell ELISpot原理

 

 

捕獲效應

同時披覆特異性不同的捕獲抗體,在一種細胞激素被捕獲後,可能會影響到其它細胞激素的分泌,這種現象稱為捕獲效應 (capture effects)或細胞激素吸收效應 (cytokine absorption effects)。

 

加入anti-CD28共同刺激

Anti-CD28 mAb與T細胞上的CD28結合,與抗原特異性反應產生共同的刺激訊號,可增強抗原特異性反應並抵銷捕獲效應。
舉例來說,IL-2捕獲抗體捕捉到T細胞分泌出來的IL-2後,便會減少IL-2所引導的T細胞刺激反應,故會進一步減弱T細胞的活化。添加anti-CD28 mAb可以回復IFN-γ的反應 (參考下圖),但仍須根據不同細胞刺激作調整,若anti-CD28 mAb濃度過高可能導致非特異性的細胞激素分泌發生。

  ▲  捕獲效應通常可藉由添加anti-CD28 mAb抵銷反應。

 

實驗步驟

 1. Coating

      將混合後的特異性單株捕獲抗體披覆在乙醇處理過的PVDF膜上。
      ▶ 沒有coating的經驗 👉 Plate Coating Guide
      ▶ 建議購買pre-coated plates減少盤與盤之間的差異

 2. Cell incubation

      將添加/未添加活化刺激物的細胞分別加到96孔盤中,並培養一段時間讓細胞分泌細胞激素或免疫球蛋白。

 3. Cytokine capture

      被活化的細胞所分析的細胞激素或免疫球蛋白會立即與96孔盤上的捕獲抗體結合。

 4. Detection antibodies

      移除細胞後,加入標記tag或生物素的偵測抗體混合物。

 5. Fluorophore-labeled conjugates

      為了放大偵測訊號,加入標記螢光基團的抗體與streptavidin後,再加入Fluorescence enhancer。

 6. Analysis

      分析盤乾燥後,利用自動化免疫斑點分析儀的不同濾片分析斑點數。
      ▶ 世翔代理 ELISpot/FluoroSpot Readers

 

產品包裝

Mabtech根據用戶的需求不同,提供客製化或商業標準化等不同包裝規格的產品。

  • FluoroSpot Flex: 客製化包裝,用戶自行搭配有興趣的分析物組合。
  • FluoroSpot Plus: 已經驗證的商品化試劑組、pre-coated分析盤可將盤與盤之間的差異性降到最低。
  • FluoroSpot Path: 提供已驗證的抗原,針對特定抗原的免疫反應進行研究,例如:SARS-CoV-2 (COVID-19)

     

 

推薦分析設備

  • Mabtech IRIS™
  • AID ELISpot Reader

     👉 點我看介紹 ELISpot&FluoroSpot Reader 免疫斑點影像分析儀

 

應用方向

  • 疫苗開發
  • 分析抗原特異性T細胞/B細胞反應
  • 分析長期免疫、記憶型免疫細胞反應
  • 評估單核球、巨噬細胞和樹突細胞等不同細胞群的功能性
  • 在免疫治療中評估相關免疫細胞的反應性
  • 評估抗原特異性T細胞/B細胞反應
  • 疫苗與佐劑開發
  • 協助癌症、HIV、結核病、瘧疾、流感等疫苗開發
  • 帕金森氏症 (PD)早期診斷
  • 結核桿菌 (TB)診斷
  • 抗原特異性T細胞反應
  • 評估自體免疫疾病相關的特異性免疫細胞反應
  • 抗原特異性細胞、毒殺型T細胞反應
  • 腫瘤抗原特異性免疫細胞反應
  • 評估免疫療法與癌症疫苗功效
  • 過敏原特異性T細胞數目可能較少,適合高靈敏性的分析方法
  • 觀察過敏相關細胞因子的分泌,例如:IL-4, IL-5與IL-13
  • 偵測過敏原特異性IgE的分泌,觀察B細胞反應性。
  • 抗原特異性B細胞反應
  • 評估排斥風險可能發生的機會

 

文獻選讀

COVID-19 疫苗開發

2020 Cell Press

A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19.

  • 利用ELISpot分析施打疫苗後IFN-γ, TNF-alpha, IL-2, IL-4, IL-6的變化,觀察SARS-CoV-2 RBD特異性T細胞的反應性。

 

細胞治療樹突細胞疫苗

2018 Nature Protocols

Promoting the accumulation of tumor-specific T cells in tumor tissues by dendritic cell vaccines and chemokine-modulating agents.

  • 利用ELISpot評估治療過程中腫瘤內特異性CTLs的數量變化,用以偵測、定量腫瘤特異性免疫反應。

 

帕金森氏症早期診斷

2020 Nature Communications

α-Synuclein-specific T cell reactivity is associated with preclinical and early Parkinson’s disease.

  • 利用triple-color IFNγ, IL-5, and IL-10 Fluorospot 分析α-syn 特異性T細胞的反應,並評估CD4+, CD8+ T細胞功能與數量。

 

自體免疫疾病多發性硬化症

2019 Journal of Autoimmunity

Myelin oligodendrocyte glycoprotein revisited—sensitive detection of MOG specific T-cells in multiple sclerosis.

  • 利用具高靈敏度的FluoroSpot偵測MS患者細胞樣本IFN-γ/IL-17A/IL-22的變化,觀察在不同實驗設計下其特異性T細胞的反應。

 

癌症研究腫瘤浸潤B細胞

2019 Cancers

Human Colorectal Carcinoma Infiltrating B Lymphocytes Are Active Secretors of the Immunoglobulin Isotypes A, G, and M.

  • 作者利用IgA/IgG/IgM FluoroSpot分析TiBc分泌免疫球蛋白的功能性,且提出FluoroSpot具有高靈敏度與低背景值等特性。

 

文獻來源

  1. Zhang et al. (2020). A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19. Cell Press 182, 1271–1283.
  2. Obermajer,N et al. (2018). Promoting the accumulation of tumor-specific T cells in tumor tissues by dendritic cell vaccines and chemokine-modulating agents. Nature Protocolsvolume 13, 335–357.
  3. Arlehamn, C. (2020) ‘α-Synuclein-specific T cell reactivity is associated with preclinical and early Parkinson’s disease’. Nat Commun. 11(1):1875.
  4. Bronge, M. (2019). Myelin oligodendrocyte glycoprotein revisited—sensitive detection of MOGspecific T-cells in multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 102:38-49.
  5. Mullins, C. (2019) ‘Human Colorectal Carcinoma Infiltrating B Lymphocytes Are Active Secretors of the Immunoglobulin Isotypes A, G, and M’. 11(6):776.

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