利用酵素方法偵測分泌特定細胞激素或免疫球蛋白的免疫細胞並進行定量。
技術特點
ELISpot (enzyme-linked immunospot assay)是種高度靈敏的免疫分析技術，可由單細胞層面偵測分泌特定細胞激素 (cytokine)或免疫球蛋白 (immunoglobulin)的免疫細胞並進行定量。
細胞激素被分泌後會立即被捕獲，不會與細胞受體結合或被蛋白酶降解，所偵測到的免疫反應更接近真實情況，被視為最靈敏的細胞分析技術之一。偵測極限通常1/100,000 cells，也適合用來偵測目標細胞數目較小的特定免疫反應。
Mabtech在ELISpot技術優化方面已有2、30年的經驗， 與時俱進、持續研究開發免疫學分析的相關試劑。
ELISpot實驗可在96孔盤中操作，再利用自動化ELISpot reader分析結果。適合快速分析大量樣本，可應用於大規模的試驗與不同領域的研究。市面上已有經FDA核可的ELISpot標準化分析試劑，可作為結核病的診斷依據。
技術原理
ELISpot原理是將免疫細胞培養在表面帶有特定捕獲抗體 (capture antibody)的96孔盤中，分為添加刺激物和無添加刺激物的組別，由免疫細胞所分泌的特定細胞激素會與捕獲抗體結合，在培養一段時間後移除細胞，後續步驟與ELISA實驗原理相似，以生物素標記的偵測抗體 (detection antibody-biotin)搭配鏈酶親和素-酵素 (streptavidin-enzyme)與受質反應，最終在96孔盤表面成看得到的斑點，每一個點即代表一顆分泌特定細胞激素的免疫細胞。
實驗步驟
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1. Antibody coating 將特異性單株捕獲抗體披覆在乙醇處理過的PVDF膜上 ▶ 沒有coating的經驗 👉🏻 Plate Coating Guide ▶ 建議購買pre-coated plates減少盤與盤之間的差異 |
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2. Cell incubation 將添加/未添加活化刺激物的細胞分別加到96孔盤中，並培養一段時間讓細胞分泌細胞激素或免疫球蛋白。 |
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3. Cytokine capture 被活化的細胞所分析的細胞激素或免疫球蛋白會立即與96孔盤上的捕獲抗體結合。 |
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4. Detection antibodies 移除細胞後，加入標記有生物素的偵測抗體。 |
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5. Streptavidin-enzyme conjugate 為了在膜上形成斑點，加入標記有Streptavidin的酵素。 |
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6. Addition of substrate 加入呈色受質並催化形成不可溶的沉澱；每個斑點代表單個被活化並分泌特定分析物的細胞。 |
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7. Analysis 利用自動化免疫斑點分析儀分析斑點數，以推算活化細胞比率。 ▶ 世翔代理 ELISpot Readers |
B-cell ELISpot
ELISpot分析技術也可用來定量分泌免疫球蛋白的B細胞，實際上ELISpot初自1983年設計開發的目的便是為了從單細胞層面分析抗體的分泌。
B-cell ELISpot可定量分泌抗原特異性抗體或非抗原特異性抗體的B細胞數目，研究中時常比較分泌抗原特異性抗體的B細胞與總B細胞的數目。
分泌抗原異性抗體的B細胞可在抗原暴露 (如：接種疫苗)後的6-9天被偵測；記憶型B細胞通常需要多株刺激後再偵測其分泌抗體的情況。
B-cell ELISpot有兩種實驗方式，皆可偵測抗原特異性的抗體。可選擇在96孔盤的膜上披覆 (A)抗原或 (B)特異性抗體，建議採取後者進行實驗，可提升斑點的鑑別度、同時可減少抗原的用量。
若需要同時偵測不同亞型的免疫球蛋白，可參考 B cell FluoroSpot assay提升分析效率。
👉 B cell profiling with ELISpot & FluoroSpot
產品包裝
Mabtech根據用戶的需求不同，提供從單獨試劑到完整分析套組等不同包裝規格的產品。
- ELISpot Flex: 提供分析試劑，受質與分析盤另購。
- ELISpot Plus: 提供per-coated分析盤、分析試劑。
- ELISpot Pro: 提供per-coated分析盤、分析試劑且簡化部分流程。
- ELISpot Path: 提供特定抗原、per-coated分析盤與分析試劑，分析特異性免疫反應。
應用方向
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文獻選讀
COVID-19 疫苗開發
2020 Cell Press
A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19.
- 利用ELISpot分析施打疫苗後IFN-γ, TNF-alpha, IL-2, IL-4, IL-6的變化，觀察SARS-CoV-2 RBD特異性T細胞的反應性。
細胞治療–樹突細胞疫苗
2018 Nature Protocols
Promoting the accumulation of tumor-specific T cells in tumor tissues by dendritic cell vaccines and chemokine-modulating agents.
- 利用ELISpot評估治療過程中腫瘤內特異性CTLs的數量變化，用以偵測、定量腫瘤特異性免疫反應。
帕金森氏症早期診斷
2020 Nature Communications
α-Synuclein-specific T cell reactivity is associated with preclinical and early Parkinson’s disease.
- 利用triple-color IFNγ, IL-5, and IL-10 Fluorospot 分析α-syn 特異性T細胞的反應，並評估CD4+, CD8+ T細胞功能與數量。
自體免疫疾病–多發性硬化症
2019 Journal of Autoimmunity
Myelin oligodendrocyte glycoprotein revisited—sensitive detection of MOG specific T-cells in multiple sclerosis.
- 利用具高靈敏度的FluoroSpot偵測MS患者細胞樣本IFN-γ/IL-17A/IL-22的變化，觀察在不同實驗設計下其特異性T細胞的反應。
癌症研究–腫瘤浸潤B細胞
2019 Cancers
Human Colorectal Carcinoma Infiltrating B Lymphocytes Are Active Secretors of the Immunoglobulin Isotypes A, G, and M.
- 作者利用IgA/IgG/IgM FluoroSpot分析TiBc分泌免疫球蛋白的功能性，且提出FluoroSpot具有高靈敏度與低背景值等特性。
文獻來源
- Zhang et al. (2020). A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19. Cell Press 182, 1271–1283.
- Obermajer,N et al. (2018). Promoting the accumulation of tumor-specific T cells in tumor tissues by dendritic cell vaccines and chemokine-modulating agents. Nature Protocolsvolume 13, 335–357.
- Arlehamn, C. (2020) ‘α-Synuclein-specific T cell reactivity is associated with preclinical and early Parkinson’s disease’. Nat Commun. 11(1):1875.
- Bronge, M. (2019). Myelin oligodendrocyte glycoprotein revisited—sensitive detection of MOGspecific T-cells in multiple sclerosis. Journal of Autoimmunity. 102:38-49.
- Mullins, C. (2019) ‘Human Colorectal Carcinoma Infiltrating B Lymphocytes Are Active Secretors of the Immunoglobulin Isotypes A, G, and M’. 11(6):776.
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