ELISPOT（Enzyme-linked immunospot）與 ELISA 原理相似，現在已經被廣泛用來偵測細胞分泌的特定反應因子，包括細胞激素（Cytokine）、趨化激素（Chemokine）或是顆粒酵素（Granzyme）。這種技術靈敏度高，可以用在細胞因子定性或免疫球蛋白分泌細胞。廣泛應用到研究感染後的免疫反應，癌症，過敏，自體免疫疾病。
ELISPOT 優勢
- 操作簡單：只需放入細胞刺激後，再呈色反應
- 靈敏度高：可達單顆細胞層級，有利於偵測少量細胞分泌激素
- 可大量篩選 : 96well 高通量快速進行實驗
- 細胞需求量小：節省細胞樣品，刺激過後的細胞還可再利用
- 接近體內真實狀況：細胞激素一分泌立即被捕獲
- 樣品範圍廣泛：新鮮或是解凍後的細胞都可進行分析
應用範圍
- 移植研究
- 疫苗效率測試
- 疫苗輔劑開發
- 自體免疫研究
- Th0/Th1/Th2 細胞轉換分析
- 癌症研究
- 過敏機制探討
- 傳染疾病研究
- 體液免疫力研究
實驗原理
Mabtech 所研發出的 ELISPOT 檢測試劑是在披覆 PVDF 膜的培養 96 微孔盤上，吸附高純度，高專一性的單株抗體；當放入細胞，經過刺激細胞釋放出細胞激素，會立即被抗體捕獲。當細胞移除後，再進一步使用生物素 (Biotin) 標記的二次抗體標示，結合酵素作用呈色，有反應的細胞會留下有染色的斑點，單顆細胞分泌越多，斑點越大。使用儀器對斑點進行計數和判讀，利用斑點數目多寡及大小，反應出細胞反應作用強弱。此法靈敏度極高，是 ELISA 靈敏度的 20~200 倍，105 顆細胞中有一顆細胞分泌都可偵測出，靈敏度接近 RT-PCR，只差在 RT-PCR 為 mRNA 層面，ELISPOT 為 Protein 層面。
Coating
Cell incubation
Cytokine capture
Detection antibodies
Streptavidin–enzyme conjugate
Addition of substrate
ELISPOT 分析
Mabtech 已經發展 ELISPOT 試劑超過 20 年，優化過試劑和實驗步驟，有各種套件和試劑適合不同物種與實驗應用。
Schematic illustration of the ELISpot assay
Antigen-specific B-cell ELISpot
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| Contents | ELISpot BASIC |
ELISpot PLUS |
ELISpot PRO |
|---|---|---|---|
| ELISpot plates | X | Pre-coated plates | Pre-coated plates |
| Capture mAb | O | X 已經 COATING | X 已經 COATING |
| Detection mAb | O | O | O |
| SA-ALP (or HRP) | O | O | O |
| Substrate | X | O | O |
| Positive control | X | O(certain analytes) | O(certain analytes) |
T-cell ELISpot
T 細胞被廣泛應用在研究特別的免疫反應，例如：特異性免疫反應、癌症、過敏和自身免疫性疾病。T-cell ELISpot 也被認為是用來開發與監控新疫苗和候選疫苗。
Human IFN-γ ELISpot
IFN-γ secretion by PBMCs incubated overnight without stimuli or with anti-CD3, phytohaem-agglutinin (PHA) or purifi ed protein derivative (PPD).
B-cell ELISpot
B-cell ELISPot 是用來研究抗體免疫反應的強大工具。主要的應用包括偵測 B 細胞對感染和接種引起的反應。
Human IgG and IgA ELISpot
PBMCs were collected before and after vaccination with Pandemrix ® and secretion of influenza A (H1N1)-specifi c IgG (left) and IgA (right) was analyzed by ELISpot.
文獻選讀
疫苗效率測試 -COVID19
2020 Cell Press
A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19.
N. Zhang et al. 分析小鼠或非人類靈長類施打 COVID-19 RNA 疫苗後 T 細胞免疫反應。
病毒效力測試– SFTSV
2019 Nature Communications
Development of a SFTSV DNA vaccine that confers complete protection against lethal infection in ferrets.
J.E. Kwak et al. 開發疫苗過程中，利用 ELISpot 分析小鼠和雪貂 (Ferrets) 經由 SFTSV 疫苗施打後，疫苗誘導中和抗體和特異性 T 細胞的反應性。
癌症研究
2014 Nature
Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens.
Prof. James P. Allison 致力於利用免疫檢查點抑制劑來治療癌症，在 2018 年榮獲諾貝爾生醫獎。
M Gubin et al. 在研究中， 多次使用 EliSpot 分析免疫檢查點抑制劑細胞治療後特異性 T 細胞的反應。
樹突細胞疫苗之研究
2018 Nature Protocol
Promoting the accumulation of tumor-specific T cells in tumor tissues by dendritic cell vaccines and chemokine-modulating agents.
N. Obermajer et al. 利用 ELISpot 協助評估樹突細胞疫苗治療過程中腫瘤內特異性 T 細胞數量變化，可偵測、定量腫瘤特異性免疫反應。
巨噬細胞之研究
2013 PLOS ONE
ApoE Production in Human Monocytes and Its Regulation by Inflammatory Cytokines
B. A.Sten et al. 利用 apoE ELISpot/FluoroSpot 從單顆細胞層面分析，患者在發炎過程中，細胞因子調節載脂蛋白的分泌。
- Zhang et al. (2020). A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19. Cell Press 182, 1271–1283.
- Gubin, M. (2014) ‘Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens’. Nature. 515(7528):577-581.
- Obermajer,N et al. (2018). Promoting the accumulation of tumor-specific T cells in tumor tissues by dendritic cell vaccines and chemokine-modulating agents. Nature Protocols volume 13, 335–357.
- J. E. Kwak et al.(2019) Development of a SFTSV DNA vaccine that confers complete protection against lethal infection in ferrets. Nature Communtions. 10:3836.
- Braesch-Andersen S. et al. (2013) ApoE Production in Human Monocytes and Its Regulation by Inflammatory Cytokines. PLoS ONE 8(11): e79908.
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