Mabtech ELISpot Pro Kit 450 300x300 1

Mabtech ELISpot Kit 酶聯免疫斑點套組

Mabtech 所研發出的 ELISPOT 檢測試劑是在披覆 PVDF 膜的培養 96 微孔盤上,吸附高純度,高專一性的單株抗體;當放入細胞,經過刺激細胞釋放 出細胞激素,會立即被抗體捕獲。當細胞移除後,再進一步使用生物素 (Biotin) 標記的二次抗體標示,結合酵素作用呈色,有反應的細胞會留下有染色的斑點,單顆細胞分泌越多,斑點越大。此法靈敏度極高,是 ELISA 靈敏度的 20~200 倍,105 顆細胞中有一顆細胞分泌都可偵測出。

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原廠介紹 – 原理
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elispot logo 2

ELISPOT(Enzyme-linked immunospot)與 ELISA 原理相似,現在已經被廣泛用來偵測細胞分泌的特定反應因子,包括細胞激素(Cytokine)、趨化激素(Chemokine)或是顆粒酵素(Granzyme)。這種技術靈敏度高,可以用在細胞因子定性或免疫球蛋白分泌細胞。廣泛應用到研究感染後的免疫反應,癌症,過敏,自體免疫疾病。

ELISPOT 優勢

  • 操作簡單:只需放入細胞刺激後,再呈色反應
  • 靈敏度高:可達單顆細胞層級,有利於偵測少量細胞分泌激素
  • 可大量篩選 : 96well 高通量快速進行實驗
  • 細胞需求量小:節省細胞樣品,刺激過後的細胞還可再利用
  • 接近體內真實狀況:細胞激素一分泌立即被捕獲
  • 樣品範圍廣泛:新鮮或是解凍後的細胞都可進行分析

應用範圍

  • 移植研究
  • 疫苗效率測試
  • 疫苗輔劑開發
  • 自體免疫研究
  • Th0/Th1/Th2 細胞轉換分析
  • 癌症研究
  • 過敏機制探討
  • 傳染疾病研究
  • 體液免疫力研究
文獻選讀

實驗原理

Mabtech 所研發出的 ELISPOT 檢測試劑是在披覆 PVDF 膜的培養 96 微孔盤上,吸附高純度,高專一性的單株抗體;當放入細胞,經過刺激細胞釋放出細胞激素,會立即被抗體捕獲。當細胞移除後,再進一步使用生物素 (Biotin) 標記的二次抗體標示,結合酵素作用呈色,有反應的細胞會留下有染色的斑點,單顆細胞分泌越多,斑點越大。使用儀器對斑點進行計數和判讀,利用斑點數目多寡及大小,反應出細胞反應作用強弱。此法靈敏度極高,是 ELISA 靈敏度的 20~200 倍,105 顆細胞中有一顆細胞分泌都可偵測出,靈敏度接近 RT-PCR,只差在 RT-PCR 為 mRNA 層面,ELISPOT 為 Protein 層面。

mabtech elispot kit g 01

Coating

Monoclonal capture antibodies are added to an ethanol-treated PVDF membrane plate.
mabtech elispot kit g 02

Cell incubation

Cells are added in the presence or absence of stimuli and the plate is in-cubated to allow cytokine secretion.
mabtech elispot kit g 03

Cytokine capture

Secreted cytokines bind to capture antibodies surrounding the activated cells.
mabtech elispot kit g 04

Detection antibodies

Cells are removed and the plate is washed before biotinylated detection antibodies are added.
mabtech elispot kit g 05

Streptavidin–enzyme conjugate

Addition of a streptavidin–conjugate enables the formation of spots on the membrane.
mabtech elispot kit g 06

Addition of substrate

A colorimetric substrate forms an insoluble precipitate when catalyzed by the enzyme.

ELISPOT 分析

Mabtech 已經發展 ELISPOT 試劑超過 20 年,優化過試劑和實驗步驟,有各種套件和試劑適合不同物種與實驗應用。

Schematic illustration ELISpot assay

Schematic illustration of the ELISpot assay

Antigen specific B cell ELISpot

Antigen-specific B-cell ELISpot

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Contents ELISpot
BASIC
ELISpot
PLUS
ELISpot
PRO
ELISpot plates X Pre-coated plates Pre-coated plates
Capture mAb O X 已經 COATING X 已經 COATING
Detection mAb O O O
SA-ALP (or HRP) O O O
Substrate X O O
Positive control X O(certain analytes) O(certain analytes)
ELISpot analysis No stimuli
ELISpot analysis Peptide stimulation
ELISpot assay principle

T-cell ELISpot

T 細胞被廣泛應用在研究特別的免疫反應,例如:特異性免疫反應、癌症、過敏和自身免疫性疾病。T-cell ELISpot 也被認為是用來開發與監控新疫苗和候選疫苗。

Human IFN γ ELISpot No stimuli
Human IFN γ ELISpot Anti CD3
Human IFN γ ELISpot PHA
Human IFN γ ELISpot PPD

Human IFN-γ ELISpot

IFN-γ secretion by PBMCs incubated overnight without stimuli or with anti-CD3, phytohaem-agglutinin (PHA) or purifi ed protein derivative (PPD).

B-cell ELISpot

B-cell ELISPot 是用來研究抗體免疫反應的強大工具。主要的應用包括偵測 B 細胞對感染和接種引起的反應。

Human IgG ELISpot
Human IgA ELISpot

Human IgG and IgA ELISpot

PBMCs were collected before and after vaccination with Pandemrix ® and secretion of influenza A (H1N1)-specifi c IgG (left) and IgA (right) was analyzed by ELISpot.

文獻選讀

疫苗效率測試 -COVID19

2020 Cell Press

A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19.

N. Zhang et al. 分析小鼠或非人類靈長類施打 COVID-19 RNA 疫苗後 T 細胞免疫反應。

N. N. Zhang et al.

病毒效力測試– SFTSV

2019 Nature Communications

Development of a SFTSV DNA vaccine that confers complete protection against lethal infection in ferrets.

J.E. Kwak et al. 開發疫苗過程中,利用 ELISpot 分析小鼠和雪貂 (Ferrets) 經由 SFTSV 疫苗施打後,疫苗誘導中和抗體和特異性 T 細胞的反應性。

J. E. Kwak et al.

癌症研究

2014 Nature

Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens.

Prof. James P. Allison 致力於利用免疫檢查點抑制劑來治療癌症,在 2018 年榮獲諾貝爾生醫獎。
M Gubin et al. 在研究中, 多次使用 EliSpot 分析免疫檢查點抑制劑細胞治療後特異性 T 細胞的反應。

M. M Gubin et al

樹突細胞疫苗之研究

2018 Nature Protocol

Promoting the accumulation of tumor-specific T cells in tumor tissues by dendritic cell vaccines and chemokine-modulating agents.

N. Obermajer et al. 利用 ELISpot 協助評估樹突細胞疫苗治療過程中腫瘤內特異性 T 細胞數量變化,可偵測、定量腫瘤特異性免疫反應。

N. Obermajer et al

巨噬細胞之研究

2013 PLOS ONE

ApoE Production in Human Monocytes and Its Regulation by Inflammatory Cytokines

B. A.Sten et al. 利用 apoE ELISpot/FluoroSpot 從單顆細胞層面分析,患者在發炎過程中,細胞因子調節載脂蛋白的分泌。

B. A.Sten et al

原廠文獻查詢
  • Zhang et al. (2020). A Thermostable mRNA Vaccine against COVID-19. Cell Press 182, 1271–1283.
  • Gubin, M. (2014) ‘Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens’. Nature. 515(7528):577-581.​
  • Obermajer,N et al. (2018). Promoting the accumulation of tumor-specific T cells in tumor tissues by dendritic cell vaccines and chemokine-modulating agents. Nature Protocols volume 13, 335–357.
  • J. E. Kwak et al.(2019) Development of a SFTSV DNA vaccine that confers complete protection against lethal infection in ferrets. Nature Communtions. 10:3836.
  • Braesch-Andersen S. et al. (2013) ApoE Production in Human Monocytes and Its Regulation by Inflammatory Cytokines. PLoS ONE 8(11): e79908.